Hopp til hovedinnhold

Spektroskopi

Vi har tidligere vist at atomspektroskopi er en effektiv og viktig analytisk teknikk. Denne teknikken baserer seg på at elektroner i atomet kan flytte seg fra et energinivå til et annet. I denne prosessen vil det enten ta opp eller sende ut elektromagnetisk stråling. I mange tilfeller vil dette tilsvare lys i det synlige området, og fenomenet er følgelig lett å observere. Denne typen spektroskopi kan også brukes til mye annet enn analyse av atomer. Molekyler vekselvirker med lys over et stort bølgelengdeområde: ultrafiolett, infrarødt og synlig lys og mikrobølger, og vekselvirkningen mellom lys og molekyler vil danne et mønster som kan gi oss detaljert informasjon om molekylets struktur. Dette mønsteret kalles for et spektrum eller et spekter.

Ultrafiolett og synlig lys-spektroskopi

Figur 2. UV-spekteret av kaffein Figur 2. UV-spekteret av kaffein Vekselvirkningen mellom molekyler og lys i det ultrafiolette og synlige området er det igjen elektronnivåene i molekylet som blir påvirket. Dette kan brukes til identifikasjon av stoffer, men også til kvantitative analyser, siden lysabsorpsjonen er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av det aktuelle stoffet i en løsning. Figur 2 viser et typisk ultrafiolett spekter.

 

 

 

Analytikere i arbeid Analytikere i arbeid

Ultrafiolett/synlig lys spektroskopi kan detektere svært lave konsentrasjoner av forbindelser dersom forbindelsene absorberer lys sterkt. Et eksempel på dette er komplekset som dannes mellom jern og o-fenantrolin. Dette gir en intenst farget løsning som kan brukes til å bestemme mengden av jern i vannprøver.

Spektra som er tatt opp ved hjelp av ultrafiolett lys gir informasjon som viser at molekylet inneholder bestemte funksjonelle grupper, kromoforer, siden ulike kromoforer absorberer lys ved ulike bølgelengder. Kromoforer er ofte kjemiske grupper med dobbeltbindinger, og finnes ofte i organiske forbindelser. En noe mer avansert bruk av UV/synlig lys-spektroskopi er studiet av såkalte metallkoordinasjonsforbindelser, der posisjonen og intensititen til de spektrale båndene kan gi detaljert informasjon om elektronstrukturen i molekylet.

 

Infrarød spektroskopi

Det er den infrarøde delen av spekteret som kan gi oss mest informasjon om funksjonelle grupper og kjemiske bindinger. Atomene i et molekyl er i konstant vibrerende bevegelse bort fra og imot hverandre, og nivåene i vibrasjonsenergien svarer til energien i den infrarøde delen av spekteret. Den infrarøde delen av spekteret ligger i frekvensområdet 1 x 1014 s-1 til 5 x 1012 s-1. Dette svarer til bølgetall (wavenumbers = antall bølger per cm) fra 4000 til 200 cm-1, den vanlige enheten å bruke i infrarød spektroskopi.

Energien i en vibrasjon mellom to atomer i et molekyl er avhengig av hva slags binding det er mellom dem og av massen til de individuelle atomene. Ved opptak av IR-spektra vil vi bare få en interaksjon når IR-strålingens energi er lik den energien som er forbundet med en bestemt vibrasjon. På denne måten kan IR-spektroskopi identifisere bestemte funksjonelle grupper i et molekyl. I organisk kjemi er dette selvfølgelig til stor nytte, spesielt hvis molekylet inneholder funksjonelle grupper som gir intense bånd. Et eksempel er karbonylgruppen (C=O) som gir et intenst bånd ved ca. 1700 cm-1, figur 3.

Figur 3. Et infrarødt spekter av etyletanoat som viser et C=O-strekk mellom 1700-1800 cm-1. Figur 3. Et infrarødt spekter av etyletanoat som viser et C=O-strekk mellom 1700-1800 cm-1.

IR-spektra opptas tradisjonelt ved å scanne frekvensområdet. Metoden ble revolusjonert etter utviklingen av IR-spektrometre med fouriertransformasjon, som gjør at spektra kan tas opp mye raskere. Fouriertransformasjon er også nyttig i mange andre analyseteknikker – se egen boks – Fourier Transform – et nyttig matematisk triks.

IR-spektroskopi er nyttig for kvalitative og strukturelle analyser, men blir lite brukt til kvantitative analyser.

Et moderne FT-IR-spektrometer Et moderne FT-IR-spektrometer Fourier transform – et nyttig matematisk triks

Vanligvis presenteres IR-spektra som en graf med prosentvis transmisjon på den loddrette
aksen og bølgetall på den vannrette. Figur 3 viser et typisk IR-spekter. Tidligere ble IR-spektra tatt opp ved å splitte den infrarøde strålingen fra IR-kilden opp i de enkelte bølgetall med et diffraksjonsgitter eller et prisme. Ved å rotere gitteret kunne de enkelte bølgelengdene etter tur sendes gjennom prøven, og en detektor registrerte så hvor mye stråling av de ulike frekvensene som slapp gjennom prøven. Dette var en tidkrevende prosess siden detektoren en stor del av tiden var opptatt med å registrere transmisjon i et bølgetallsområde der det ikke var absorbans i det hele tatt.

Et tradisjonalt dobbeltstråle IR-instrument. Instrumentet sammenlikner intensiteten av referansestrålen med den som passerer gjennom prøven. Et tradisjonalt dobbeltstråle IR-instrument. Instrumentet sammenlikner intensiteten av referansestrålen med den som passerer gjennom prøven.

I moderne instrumenter er diffraksjonsgitteret kuttet ut. I stedet sendes en puls av IR-stråling mot prøven. Denne pulsen inneholder stråling over hele det aktuelle bølgetallsområdet. Etter å ha passert gjennom prøven, vil elektromagnetiske bølger med ulik frekvens interferere med hverandre (de adderes til hverandre eller nuller hverandre helt eller delvis ut, avhengig av om de er i fase eller ute av fase). Detektoren registrerer interferensmønsteret, og dette inneholder all informasjon som er nødvendig for å lage et standard IR-spekter. For å få til dette må det anvendes en datamaskin. Det matematiske grunnlaget for dette ble utviklet av den franske matematikeren Jean-Baptiste Fourier.

Et Fourier transform IR-instrument. Et Fourier transform IR-instrument.

Fouriertransformerende (FT) instrumenter har også den fordelen at de tar opp spektra raskt. I tillegg kommer det at dersom signalene er svake, kan forholdet mellom signal og støy forbedres ved at det sendes en rekke gjentatte pulser gjennom prøven og summen av alle signalene inn til detektoren kan så brukes til å konstruere et godt IRspekter. På den måten vil FT-IR-instrumenter være mer følsomme enn tradisjonelle IR-instrumenter.

Fouriertransformasjon brukes også i opptak av UV-VISspektra, mikrobølgespektroskopi, massespektrometri og NMR-spektroskopi.

Mikrobølgespektroskopi.

I tillegg til vibrasjon i kjemiske bindinger kan funksjonelle grupper også rotere rundt en binding, spesielt hvis forbindelsen er i gass- eller væskefase. Energinivåene som er forbundet med dette ligger i det samme området som stråling i mikrobølgeområdet. Teknikken er best egnet for molekyler i gassfase der ulike energinivåer er veldefinerte og avstanden mellom energinivåene er avhengig av molekylets treghetsmoment – en egenskap som måler hvordan massen i et molekyl er fordelt. Molekylet som helhet må ha et dipolmoment for at det skal være mulig å ta opp et mikrobølgespekter. Et molekyl som har et dipolmoment har en asymmetrisk fordeling av elektrisk ladning. På grunn av tetraederstrukturen har ikke gassen metan noe dipolmoment, selv om hver enkelt C-H-binding har det. Den romlige strukturen av metan er symmetrisk, og denne symmetrien «nuller» ut de enkelte dipolmomentene. Mikrobølgespektroskopi gir nøyaktig informasjon om lengden av de kjemiske bindingene, og ut fra dette informasjon om molekylets struktur på forbindelser med dipolmoment.

Massespektrometri

Forskerne Einar Solheim og Kari Fladmark er sentrale i oppbyggingen av et nasjonalt MS-laboratorium for proteinstudier. Forskerne Einar Solheim og Kari Fladmark er sentrale i oppbyggingen av et nasjonalt MS-laboratorium for proteinstudier.

Massespektrometri er et av de kraftigste verktøyene vi har både for strukturbestemmelse og kvantitative analyser. En vanlig måte å utføre massespektrometri på er å overføre molekyler til gassfase ved hjelp av varme og vakuum. Dette gjøres i en del av instrumentet som kalles ionekilden og her blir gassmolekylene bombardert med en stråle av elektroner. Dette bryter opp molekylene i mindre, ladde fragmenter som blir akselerert ut av ionekilden og inn i selve masseseparatoren som separerer ioner etter forholdet mellom masse og ladning. Masseseparatoren kan være bygd opp etter mange ulike prinsipper, men er ofte basert på separasjon ved hjelp av elektriske eller magnetiske felt. Det er en nøye sammenheng mellom molekylets struktur og hvilke fragmenter som dannes. På denne måten vil hver enkelt forbindelse ha sitt særegne fragmentmønster som det deler med ingen eller veldig få andre forbindelser. Dette er en av grunnene til at massespektrometri kan brukes til sikker påvisning av et stoff i en ukjent prøve. Ved analyse av ukjente forbindelser kan man studere dette mønsteret og få gode indikasjoner om molekylets struktur. Det finnes også dataprogrammer som kan hjelpe til med strukturbestemmelsen.molekylvekten til proteinet kan beregnes. En annen måte å ionisere forbindelser med høy molekylvekt på er med laserdesorpsjon. Her blir for eksempel et hydrolyseprodukt av et protein blandet med en matriks av en lavmolekylær organisk forbindelse. Denne blandingen blir lagt på en liten plate som settes inn i massespektrometret, og platen blir bombardert med pulser av laserstråling. Matriksen som peptidblandingen er blandet med har den egenskapen at den absorberer lys av den bølgelengden som laseren sender ut. Denne energien blir så fordelt ut til peptidene, som dermed kastes ut fra matriksplaten som ladde substanser og separeres og registreres av masseseparatoren. En hydrolyseblanding av et bestemt protein vil alltid gi det samme peptidmønsteret. Det er bygd opp store databaser over slike mønstre, og ved å søke i disse kan man finne ut om et protein en har isolert er kjent fra før. Disse såkalte MALDI-ionekildene (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) er ofte kombinert med såkalte flyvetidsmasseseparatorer (TOF – Time Of Flight). Her foretas det en nøyaktig måling av tiden det tar for et ion å fly gjennom masseseparatoren. Tunge ioner bruker lang tid og lettere ioner bruker kortere tid. Nobelprisen i kjemi for 2002 ble tildelt to forskere, John B. Fenn og Koichi Tanaka, som har bidratt til utviklingen av disse nye ioniseringsteknikkene.

 

John B. Fenn (t.v.) og Koichi Tanaka. John B. Fenn (t.v.) og Koichi Tanaka.

Tidligere var massespektrometri stort sett avgrenset til analyse av forbindelser som det var mulig å få over i gassfase. Veldig polare forbindelser eller forbindelser med høy molekylvekt lot seg vanskelig analysere med massespektrometri. I den senere tid har bruk av massespektrometri økt svært raskt. Dette skyldes at det er funnet opp teknikker som kan lage ioner av store molekyler, som for eksempel peptider og proteiner, uten at de nedbrytes i løpet av denne prosesseen, eller en kan velge en kontrollert oppbryting i noe mindre fragmenter. En måte å gjøre dette på er ved såkalt elektrospray-ionisering. Her blir en løsning av det aktuelle stoffet pumpet inn gjennom et kapillærrør som det er lagt en spenning på (2,5–5 kV). Dette skaper en sky av bitte små dråper med ladning der løsningsmidlet etter hvert damper av og etterlater for eksempel et protein med mange ladninger. Forholdet mellom masse og ladning blir registrert ogmolekylvekten til proteinet kan beregnes. En annen måte å ionisere forbindelser med høy molekylvekt på er med laserdesorpsjon. Her blir for eksempel et hydrolyseprodukt av et protein blandet med en matriks av en lavmolekylær organisk forbindelse. Denne blandingen blir lagt på en liten plate som settes inn i massespektrometret, og platen blir bombardert med pulser av laserstråling. Matriksen som peptidblandingen er blandet med har den egenskapen at den absorberer lys av den bølgelengden som laseren sender ut. Denne energien blir så fordelt ut til peptidene, som dermed kastes ut fra matriksplaten som ladde substanser og separeres og registreres av masseseparatoren. En hydrolyseblanding av et bestemt protein vil alltid gi det samme peptidmønsteret. Det er bygd opp store databaser over slike mønstre, og ved å søke i disse kan man finne ut om et protein en har isolert er kjent fra før. Disse såkalte MALDI-ionekildene (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) er ofte kombinert med såkalte flyvetidsmasseseparatorer (TOF – Time Of Flight). Her foretas det en nøyaktig måling av tiden det tar for et ion å fly gjennom masseseparatoren. Tunge ioner bruker lang tid og lettere ioner bruker kortere tid. Nobelprisen i kjemi for 2002 ble tildelt to forskere, John B. Fenn og Koichi Tanaka, som har bidratt til utviklingen av disse nye ioniseringsteknikkene.

Er bakgrunnsstoff for